ENEMIGOS DE LA FE: Lisis o lisogenia y el bacteriófago Mu

Hoy trataremos sobre los factores que determinan la vía que seguirá nuestro ya tan conocido bacteriófago Mu. Aunque aún, como de muchos virus, se sabe poco sobre éste y su regulación y sobretodo de las relaciones que posee con el huésped a la hora de la toma de una decisión como ésta.
Comencemos, pues:
Una de las cosas que sí que sabemos es que un modo de establecer el estado lisogénico, es mediante la expresión del represor, gen c, (del que ya se ha hablado en publicaciones anteriores). Una de la curiosidades de la transcripción de este, es que se realiza hacia la izquierda y que posee dos promotores en secuencias intergénicas, como son el  PC-1 y el PC-2, siendo el más potente de los dos el promotor PC-2. También se ha hallado un represor lisogénico, el cual se une a la región promotora-operadora (core promotor o promotor principal) del operón, bloqueando de éste modo la expresión. Éste transcrito represor, se une a zonas concretas del genoma de Mu, denominadas O1, O2 y O3, entre el gen c y el gen ner.
La transcripción de este represor está regulada de modo negativo debido al solapamiento del gen ner y los lugares de unión O2 y O3.
La decisión lítica/lisogénica, también está controlada por dos proteínas de E. coli. Las cepas mutantes para la DNA girasa y el factor huésped integrados (IHF, producto de los genes himA y himD) restringe la capacidad del desarrollo lítico. Aunque in vivo se encuentran casos de este factor knockeado y ciclo lítico, conjuntamente, lo cual lleva a la conclusión de que éste transcrito no simplemente influye en su presencia u ausencia, sino que su nivel regulatorio parece aún esconder múltiples secretos.
La infección lítica, suele darse en cepas sensibles, que poseen una mutación ts en el gen represor lisogénico. A 42 grados, la producción vírica comienza a los 25 minutos, y la lysis es completada a los 55-60 minutos. EL tiempo de generación varía ampliamente conforme las condiciones a las que es sometido, ya sea temperatura, concentración de células, es decir, éste, al igual que otros bacteriófagos y los seres vivos, posee una determinada norma de reacción (es decir, la variación fenotípica de un determinado genotipo), al igual que las temperaturas cardinales de una Salmonella, por ejemplo, aunque siendo éste uno de los múltiples factores que da forma al genotipo y que produce ciertas tendencias en el microorganismo. La tasa de formación de calvas de éste (pfu, plaque forming unit) no ha sido determinada aún. Además el título del mismo es verdaderamente inestable, ya que pierden hasta el 90% de su título (pfu/mL), en cuestión de un par de semanas.
La transcripción para el ciclo lítico de Mu, comienza en Pe, el cual está solapado con PC-2, pero la transcripción de éste no se da hacia la izquierda, sino, que es hacia la derecha, dando un transcrito de unas 8.5 kb de longitud. Uno de los genes tempranos de éste ciclo, es ner. En éste caso los genotipos ner – (knockout), no producen calvas, por lo que se hace patente la esencialidad de éste en el ciclo lítico.
Como conclusión; una buena teoría es que éstos bacteriófagos habrán desarrollado diversos mecanismos, mediante los cuales puedan determinar el estado de la célula, en la que se encuentran y discernir, entre el ciclo, en función de lo que puedan parasitar de la misma. Es decir, una célula en la que se encuentren altas concentraciones de nutrientes u otros transcritos que induzcan a al ciclo lítico, tenderá a éste, más que aquella en la que no hay nutrientes suficientes como para explotar la célula y crear miles de copias, tendiendo entonces a un ciclo lisogénico.
A todos los fans, felices vacaciones y hasta la semana que viene.
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ENEMIGOS DE LA FE: Fago Mu y ciclo vital

Hoy trataremos un poco de los huéspedes susceptibles a infección por parte del fago Mu, y de en qué condiciones de laboratorio podremos realizar esto. Para los grandes fans, siento haber adelantado en la entrada anterior la decisión litico/lisogénica, «so sorry fans».

La mayoría de los estudios que meplean al fago Mu se realizan sobre strains (cepas) de E. coli K12 como huésped. La tasa de adsorción del virus suele variar dependiendo de las condiciones que tomemos para la infección. En un medio con las siguientes características: de 5-10 mM Ca2+ y Mg2+ la adsorciónes de un 80-95% mediante 15 minutos de incubación a 37oC. A pesar de las técnicas de transfección que se suelen hacer únicamente con el DNA vírico en el caso del fago Mu, esto no es posible.

Cuando un fago Mu infecta al huésped, su DNA es inyectado desde el extremo derecho. Se pueden conseguir estructuras víricas de Mu, en forma circular gracias a una proteína de unos 64-kD, que se une de forma no covalente. Esta forma circular sólo se ha probado como eficaz, en algunos esferoplastos ( los cuales constituyen organismos bacterianos, desprovistos de su pared celular, que por una parte tiene el lado positivo de que puede ser infectado por el virus más incompetente, pero por otra se ven afectadas de un modo enorme las capacidades osmóticas celulares, obteniendo un organismo muy débil), de tipo recBC. Se cree que esta proteína que protege de las exonucleasas y habilita al fago Mu, proviene del gen N.

El fago Mu que infecte si desea producir más entidades víricas debe iniciar el ciclo lítico, o quizás pase a un ciclo lisogénico (siendo uno de los mayores determinantes de la misma el gen C.

Un rasgo único del fago Mu, es que siempre se encuentra integrado en el genoma del huésped.  De modo posterior a la infección uno puede apreciar una alta frecuencia de integración en el genoma, lo cual ocasiona el ciclo lítico, o una baja frecuencia de inserción cuando se trata del ciclo lisogénico. En el primer caso los genes necesarios para estos eventos son el A y el B.

Normalmente en una infección, son destruidas (ciclo lítico), siendo finalmente la porción lisogénica del 1-10%. Mediante técnicas ya bien depuradas de fagos Mu-resistentes, a algunos fármacos, ya se pueden aislar individuos del ciclo lisogénico.

Las secuencias específicas que corresponden a los extremos del Mu linear, denominadas sitio att, son empleados para la integracón vírica. El tipo de inserción que produce, en el caso de ausencia de delección, es el modelo propuesto por Campbell para el fago λ (integración del mismo). (Campbell, 1971).

Y ahora sí, para la próxima entrada, trataremos la decisión entre el ciclo lítico o lisogénico. Muchas gracias a todos los followers, y hasta la próxima semana.

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ENEMIGOS DE LA FE: El virus que se muerde el 5′

Para aquellos a los que les extrañe el título, como analogía a la pescadilla que se muerde la cola, veremos un ejemplo de parásito parasitado, en este caso, nuestro gran protagonista el fago Mu y de modo más conciso los Mini-Mu’s que se insertan en otros virus, con la finalidad de analizar mutantes víricos o asignar la clasificación de gen esencial a aquellos que lo sean.

Normalmente los genomas de los virus infecciosos no suelen ser capaces de ser objeto de estudios de transposición, pero hoy veremos un modo de llevar a cabo una inserción in vivo.

El bacteriófago Mu, a expensas de parecer repetitivo, es uno de los elementos móviles génicos más conocidos, y el primero para el que se hizo una transposición in vitro. La reacción in vitro para un virus tampoco lleva ninguna complejidad específica, es más parece insultantemente fácil. Cual recetario de cocina, necesitamos de: Un huésped, un virus el cual vaya a ser infectado, el Mini-Mu, el reporter gene y la proteína Mu A (transposasa).

Como ya hemos dicho, no precisa de requisitos especiales, simplemente se dará la inserción aleatoria de nuestro Mini-Mu en el genoma vírico. La reacción in vitro, nos dará una huella básica de la inserción, la característica firma de Mu, una duplicación de 5 pb en el lugar de inserción.

El huésped del que trataremos es uno muy conocido, una proteobacteria, gammabacteria, enterobacteria, vease E. coli, el bacteriófago que mutaremos será el PDR1 (familia tectiviriae) , el cul también infecta a otras enterobacterias como Salmonella enterica. Una de las características de este virus, es que posee una proteína covalentemente unida en el extremo 5′ y una membrana dentro de la cápside. Posee unas casi 15 kbp de longitud genómica y es un virus de doble cadena, que carece de fase de RNA.

La transfección al huésped se realiza mediante electroporación, la cual ya nos habilita una infección efectiva de PDR1. Otra característica importante es el empleo de Mini-Mu con un marcador como es el gen lacZ, del cual carecen estas E. coli y mediante el uso de un medio modificado (X-gal), obtendremos en los casos de transposición eficiente, colonias modificadas (color azul). La estructura del Mini-Mu se muestra a continuación:



Y el procedimiento esquemáticamente es como sigue en la imagen:

Y como resultado de este, dependiendo de la inserción en regiones esenciales o no:

El resultado que veremos será:

1. Colonias de color azul: El transposón se ha insertado en una región esencial, por lo que no se ha producido la lísis de la bacteria, ya que el bacteriófago permanece inviable, pero sí se ha podido degradar la lactosa y por tanto hacer que el medio aparezca de tonalidad azul.

2. Colonias de color blanco: El transposón no ha sido insertado, y tampoco ha sido infectada esta bacteria, por lo que no posee ni un fago ni otro.

3. Calvas de color azul: La bacteria (o el lisado que queda de la misma, víctima de PDR1), pasa a formar una calva, lo que nos indica que se ha producido la transposición (por el color azul) y que además se ha dado la transfección (por el lisado). Será en estas calvas en las que encontraremos mutantes de nuestro PDR1.

4. Calvas de color blanco: La bacteria ha pasado a ser un producto vírico, ergo, la transfección se ha producido, pero no se ha dado la transposición.

En conclusión, cada vez más el fago-Mu, nos parece una herramienta que podríamos encontrarnos en cualquier «taller» el pos de la biotecnología.

En próximas entradas trataremos la gran decisión de un virus, ciclo lítico o lisogénico.

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ENEMIGOS DE LA FE: Una visión general del genoma del fago Mu

Hoy trataremos sobre la composición y estructura del material genómico del bacteriófago Mu.

La estructura de su DNA es una doble hélice lineal.En tanto a su composición, la proporción de (C+G) es de un 51%. Respecto a la composición general, no hay una uniformidad en la distribución de las bases en el DNA.

Mediante varios estudios de desnaturalización y renaturalización del DNA vírico, se observaron varias estructuras peculiares que permitieron la segmentación  del genoma en tres dominios α, β y G; en estos estudios se observó que algunas partes se volvían a unir de modo correcto (α), pero otras por su parte originaban una burbuja, u orquilla en la que ambas hebras se encontraban separadas (siendo este dominio denominado G). También detectaron que al final de uno de los extremos en la renaturalización las hebras se hallaban escindidas (β).

Región α:

Siendo esta el extremo 5′ (izquierdo) y se extiende hasta el inicio del segmento G. Uno de los primeros genes que nos encontramos, siendo éste de transcripción temprana; es el denominado, represor determinante o inmunidad, éste gen junto con otro denominado «ner» realizan una regulación que determina procesos líticos o lisogénicos.  Éstos virushan sido aislados tanto en su mutación virulenta, como en su mutación lisogénica (Howe, 1972; Van Villet et al., 1978a).

Los siguientes genes que encontramos son los denominados «A» y «B» (también implicados en la transcripción temprana), teniendo estos importantes funciones en transposición y replicación. Estos genes hasta ahora nombrados constituyen genes esenciales. A los que les siguen un six-pack (génico) semiesenciales y también de transcripción temprana, cim, kill, gam, sot, arm y lig; que controlan respectivamente inminudad (actuando como gen complementario para aquellos Mu’s que carezcan del extremos c y ner), destrucción ( este gen se encarga de acabar con la vida del huésped incluso cuando la replicación de Mu es bloqueada), unión al DNA husped (este gen está implicado en la protección contra la exonucleasas que circulan por la célula), estumulación de la transfección (facilitando de este modo mediante sus productos, la entrada en el huésped en caso de únicamente encontrarse sin proteínas de encapsidación), estiumulación de la replicación de Mini-Mu’s (o por hacer una analogía, los enhancers eucariontes, que aumentan la frecuencia de transcripción de las zonas adyacentes, al igual que este gen; es importante comentar que, alguna delección en esta zona producirá calvas de lisis más pequeñas, lo cual resulta obvio, a menos transcripción, menor concentración de partículas víricas) y para finalizar función topoisomerasa.

Después de estas secuencias encontramos el gen C , el cual es necesario para la transcripción de los genes tardíos (aunque el mecanismo de regulación permanece desconocido). A continuación lys es esencial para la lísis celular del huésped, mientras que una tanda de genes (D, E, H, F, G, I, T y J) son los responsables de la formación de las proteínas que componen la cabeza del virus. Y la tanda de genes que codifican para la cola, se encuentran adyacentes a los anteriormente mencionados, siendo en este caso: K, L, M, Y, N, P, Q, V, W, R, S y U. A partir del gen C en direción 3′ o hacia la derecha encontramos los genes de transcripción tardía.

Región G:

El gen S que reside en la misma, al igual que forma parte de el segmento α, como el gen U, ambos como ya hemos dicho antes implicados en la generación de las fibras de la cola.

Región β:

A la cual también se le denomina el extremo derecho (R, como anteriormente denominamos). En esta región se encuentran dos genes no esenciales, denominados gin y mom que se encargan respectivamente de la recombinación necesaria para la inversión del segmento G; y modificación del DNA de Mu, protegiéndole de limitaciones.

El próximo día hablaremos de cómo podemos emplear el fago Mu, para hacer estudios de genética reversa, respecto a la función génica de otros virus. Es decir, parasitismo al cuadrado.

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ENEMIGOS DE LA FE: Aplicación del bacteriófago Mu como vector.

Hoy veremos una de las múltiples utilidades dle bacteriófago Mu, en este caso como sistema para integración/amplificación de un gen de interés, en caso de bacterias Gram-negativas, en concreto nos centraremos en una muy conocida y estudiada, E. coli.

Para este trabajo son empleados lo que denominan mini-Mus, es decir, secuencias parciales de la original del virus, según su finalidad pueden ser, de transposición, replicación o empaquetamiento; otros incluso sólo poseen secuencias terminales del fago, denominadas mini-Mu(LR).

Para la síntesis de sustancias de interés, o para transposición replicativa, se suelen emplear Mini-Mus que carecen de los genes que codifican para funciones de  encapsulamiento o empaquetamiento.

Normalmente no suelen ser tan fácil ya que muchas veces estos Mini-Mus no suelen ser estables debido a su pobre genoma, y deben de ir acompañados de otros plásmidos para estabilizar su inserción (y por la tanto la de nuestro gen de interés en el organismo). Hay diferentes modos de llevar esto a cabo, pero uno de los más empleados, haces uso de un plásmido integrativo que consiste en el Mini-Mu(LR) como primer componente y un plásmido de refuerzo que posee los genes inducibles MuA y MuB, que como contrate originan un replicón inestable, aunque este puede ser eliminado fácilmente de la célula.

Otro mecanismo empleado suelen ser un elemento génico denominado E, en trans, que hace que el Mini-Mu pase de ser (L/R) y sólo tener los extremos terminales genómicos, a ser (LER) y poseer además de estos extremos una secuencia denominada E que influye positivamente en la transposición. De hecho en comparaciones de efectividad en la transposición entre los Mini-Mu (LR) y los (LER) se muestra un aumento de dos órdenes de magnitud en la eficacia de transposición de los Mini-Mu(LER).

Ahora una vez ya construido el vehículo, podemos insertar cualquier cosa en el ya sea un marcados y nuestro gen de interés, o simplemente un gen mutado con la finalidad de knoquear al wildtipe. A continuación se muestra un cuadro con las múltiples aplicaciones que ha tenido este fago en E.coli:

Todas estas inserciones se han hecho mediante un componente Mini-Mu doble, ya sea uno de los antes mencionados u otros, los cuales fueron insertados en el cromosoma de E. coli, con la finalidad de crear nuevas cepas para la investigación y la ingeniería metabólica (especialmente en la producción de aminoácidos).

La expresión de los insertos mediante los Mini-Mu, normalmente dependen del número de copias que poseen en el cromosoma bacteriano. Incluso se puede determinar su número de copias mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa inversa.

En la próxima entrada trataremos de cómo podemos emplear el fago Mu, para la modificación y el análisis funcional de otros genomas vriales

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ENEMIGOS DE LA FE:El Bacteriófago Mu

Antes de comenzar con el blog como tal, quiero presentar la metodología del mismo. El blog constituye entradas periódicas, usualmente en intervalos semanales. Las entradas contendrán tanto información física como en soporte electrónico, es decir, tanto libros, como artículos referidos al tema, los cuales normalmente serán de contenido libre. Sin más dilación hablemos ya del tema de hoy.

Introducción:

El fago Mu fue descubierto accidentalmente cuando una cepa de E. coli estaba siendo empleada en un experimento de lisogenia con el fago P1, en un experimento que realizó en tales años, Taylor (1963). La primera observación que hizo el mismo fue que en el carácter atemperado del fago (bacteriófago para los menos acostumbrados) habitaba una increible capacidad para provocar mutaciones, por lo que se denominó Mu de Mutador (Mutator).

El fago fue objeto de varios análisis genéticos de ligamiento, gracias a los mismo Taylor pudo conformar que las mutaciones que aparecían en estas cepas de E. coli eran producto de la inserción del fago en los genes del huésped. La perspicacia de Taylor le ayudó a trazar líneas paralelas entre la habilidad de Mu de ocupar muchos loci cromosómicos y la capacidad de knoquear estos genes.

Debido a las propiedades únicas del fago, ha sido objeto de un grueso de investigaciones, centralizadas en la extraordinaria capacidad de causar mutaciones como la amplia variedad de reorganizaciones génicas que causa.

Otro origen del interés del mismo son los estudio en genética reversa (es decir en la discriminación de la función génica), debido a su capacidad para suprimir la función génica (KO génico), las propiedades del fago han sido explotadas en estudios tanto de función, como de estructura genética. Nombro algunos ejemplos de artículos de esta índole: Faelen and Toussaint, 1976; Toussaint and Resibois, 1983; Casadaban and Chou, 1984).

Además de estas funciones que la sociedad investigadora ha atribuido al fago como herramienta de trabajo, esta «bio-herramienta», también ha sido empleada en estudios estructurales de las colonias bacterianas y su organización (Shapiro, 1984).

Trataremos algún día sobre cómo son llevados a cabo estos experimentos, mediante el uso de papers (artículos) y también los enfocaremos desde un ángulo más estructural y funcional del mismo, con la finalidad de este análisis de comprender a esta «bio-herramienta».

Características básicas:

1. El fago Mu posee una simetría icosaédrica (en su cabeza) y una cola contráctil.

Fago Mu

2. La base de la cola termina en forma de plana, de la que emanan las fibras del mismo.

3. Una especie de protuberancia une la cabeza con la cola.

4. La densidad del fago es de 1468 g/ml.

5. El DNA se encuentra encapsulado con las proteínas de la cabeza, mediante un mecanismo determinado.

Estas estructuras serán posteriormente tratadas a un nivel más molecular, por supuesto.

Hasta la próxima entrada.

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